Işık Mikroskobu

ÖZELLİKLERİNİ ve DOĞRU KULLANMASINI BİLİYOR MUYUZ?

Mikrobiyolojinin babası olan Antonie van Leeuwenhoek kan hücrelerini keşfeden ilk insandır.

Bazı kaynaklar ilk bileşik mikroskobun Hollandalı Zacharias Janssen (1580-1638) tarafından babasının yardımı ile 1595 yılında yapıldığını ileri sürer. Daha sonraları Hollanda’nın Delft kentinde bir manifaturacının yanında çalışan Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723), hobi olarak geliştirdiği (kumaş dokusunu incelemek için camları bileyerek mercekler yapıyordu) basit bir mercek, bronz vida ve plakalardan oluşan mikroskobu  yapmıştır (Resim 1). Bu mikroskopla eritrositleri, bakterileri ve sperm hücrelerini inceleyerek resimlerini çizmiş ve bunları 1674’de “Philosophical Transactions of the Royal Society of London”da yayımlamıştır. Bu çizimler yıllarca unutulmuş, ancak bilim gelişmeye başlayınca önemleri ortaya çıkmış ve hayretle karşılanmıştır. Leeuwenhoek’un mikroskobunun 270 kez büyültme gücüne sahip olduğunu unutmayalım…

Daha sonraki yıllarda küçük cisimleri ve canlıları incelemek amacıyla kullanılan mikroskobun gelişmesine birçok araştırmacı katkıda bulunmuştur. Görüntünün niteliğini artırmak için aydınlatma sistemi ve merceklerde büyük değişiklikler yapılmıştır.

Mikroskopla uğraşan her hekimin iyi bir görüntü elde edebilmek için bu laboratuvar aracının özelliklerini iyi bilmesi ve onu doğru kullanması gerekir.

Mikroskobun Yapısı

Prof Dr Şeref İnceman’ın ilk Leitz marka mikroskobu (1949)

Işık mikroskobu başlıca üç kısımdan oluşur: ışık kaynağı, optik kısım ve gövde.

•  Işık kaynağı. İncelenecek nesneyi  aydınlatmak için ayna ya da lamba kulanılmaktadır. Günümüzde kullanılan mikroskoplara ışık kaynağı (lamba) ve ışığı incelenecek cisim üzerinde toplayan kondansör eklenmiştir. Kondansör bir mercek ve diyafram’ dan oluşur. Kondansörün aşağı ve yukarıya doğru hareketi bir vida ile sağlanır; saydam cisimlerin daha iyi görülebilmesi için kontrast ayarını yapmakta kullanılır.
• Optik kısım; Işık mikroskoplarında mercek sistemleri görüntü tübü üzerine yerleştirilmiş objektifler ve oküler’ den oluşmaktadır. İncelenen cisme yakın olan ya da bakan mercekler objektiftir. Genellikle farklı büyültmedeki (x5, x10, x20, x40) üç veya dört objektif döner bir disk (revolver= objektif topu) üzerine yerleştirilmiştir. Objektiflerin büyültme güçlerinin kolay fark edilebilmesi için üzerlerinde değişik renkte halkalar vardır. En güçlü objektif x100 büyültme gücüne sahiptir. Bu objektifle meydana gelen görüntü bozulmaları cisim ve objektif arasında immersiyon yağı kullanılarak önlenir. Bu nedenle immersiyon objektifi olarak adlandırılır. Mikroskobun görüntü tübünün üst kısmında gözle bakılan oküler bulunmaktadır. Okülerlerin büyültme güçleri genellikle x10’dur. Bir mikroskobun büyültme gücü = (objektif x oküler)’dir. İmmersiyon objektifi (x100) kullanılırken görüntü 1000 defa büyültülmüş olur. İncelenen cisim küçük objektifle (x20) 200 defa, büyük objektifle (x40) 400 defa büyültülmektedir. Değişik marka mikroskoplarda farklı büyültmede objektif ve okülerler kullanılmaktadır.
• Mikroskobun gövdesi (taşıyıcı kısım) ayak, tabla, taşıma kolu ve ayar vidalarından oluşmaktadır. İncelenecek cisim lam üzerine konduktan sonra mikroskobun tablasına yerleştirilir. Tabla üzerinde lamın sabitlendiği klipsler veya hareket ettirildiği vida sistemi bulunmaktadır. Görüntüyü bulmak ve netleştirmek için görüntü tübünü hareket ettiren makrovida ve mikrovida’dan yararlanılır.. Görüntü makrovida ile bulunurken, netlik mikrovida ile sağlanır.

İncelenecek Cisimin Hazırlanması

Mikroskopta incelenecek obje lam adı verilen dikdörtgen bir cam (76 x 26 mm) üzerine konur. Lam üzerine konan cisim boyalı veya boyasız incelenebilir. Lam üzerine konan obje preparat olarak adlandırılır. Sıvı içindeki objeler incelenirken objektiflerin kirlenmemesi için lamın üzerine lamel (22 x 22 mm) adı verilen çok daha ince (0,13 – 0,17 mm) bir cam konur. İmmersiyon objektifi lam ile lamel arasındaki sıvı preparatların incelenmesinde kullanılmaz. Lam üzerine tespit edilerek boyanan preparatlar ise immersiyon objektifi ile incelenir.

Işık Mikroskobunun Kullanılması

Mikroskobun ışık ayarının yapılması

İyi görüntü için ışık ayarı çok önemlidir. Ayar yapılırken kondansör yukarıya doğru kaldırılır. Daha sonra oküler yerinden çıkarılır. En küçük objektif (x20) aşağıya kadar indirilir ve görüntü tübünün içine bakılarak diyafram açıklığının şekildeki gibi %80 açık olması sağlanır. Diyaframın açıklığı %30 olduğunda ışık tam merkezde olmalıdır. Diyafram kapatıldıkça görüntünün kontrastı artar. İmmersiyon objektifi kullanılırken kondansör mümkün olduğu kadar yukarı kaldırılır.

Mikroskobu kullanırken nelere dikkat etmeli ve özen göstermeliyiz?

1. Mikroskopların pahalı aletler oldukları unutulmamalıdır. Dikkatli kullanıldıklarında çok uzun yıllar bize hizmet verirler. Mikroskop kullanılırken dikkat edilmesi gereken önemli noktalar aşağıda belirtilmiştir.
2. Mikroskop taşınırken bir elle ayaklarının altından, diğer elle de kolundan tutulmalıdır.
3. Kullanmadan önce ve kullandıktan sonra en küçük objektifin (boyu en kısa olanıdır) görüntü tübünün önünde olmasına dikkat edilmelidir. Diğer büyük büyültmeli objektiflerin boyları daha uzun olduğundan mikroskobun tablasına çarpma riskleri vardır.
4. Sıvı içindeki bir cisim inceleneceği zaman lamın üzerindeki sıvı damlası lamel ile kapatılır. Aksi takdirde görüntü netleştirilmeye çalışılırken yanlışlıkla sıvı içine giren objektifler zamanla bozulabilir.
5. Görüntüyü bulmak için küçük objektif lamele mümkün olduğu kadar yaklaştırılır. Bundan önce ışık ayarlarının yapılmış olması gerekmektedir. Daha sonra objektif makrovida ile yukarıya kaldırılırken görüntü bulunur. Mikrovida ile ince netlik ayarı yapılır. Görüntü bir kez bulunduktan sonra diğer objektiflerle görüntü için sadece mikrovida ile hafif oynamak yeterli olacaktır.
6. Objektiflerin preparata çarpmamasına dikkat edilmelidir. Aksi takdirde objektifin merceği zarar görebilir ya da preparat kırılabilir. Görüntü elde edilemezse bir önceki adım tekrarlanır. Boyalı preparatların incelenmesinde görüntü bulunduktan sonra lamın üzerine bir damla immersiyon yağı damlatılarak x100 objektif kullanılır. Bu aşamada netlik ayarı için mikrovidanın kullanılması yeterlidir. Makrovida kullanılarak aşağıya doğru netlik ayarı yapılırsa objektif preparata çarparak onu kırabilir. İncelenecek obje preparatın üst tarafında olmalıdır. Boyalı obje preparatın altında kalırsa, immersiyon objektifi en aşağıya indirilse bile görüntü elde edilemez.
7. Mikroskobun merceklerine elle dokunulmamalıdır. Temizlik için yumuşak kaliteli tuvalet kağıdı kullanılır.
8. Kullanıldıktan sonra mikroskobun ışığının kapatılması unutulmamalıdır. En sık yapılan hatalardan biri ışığın açık bırakılmasıdır. İnceleme bittikten sonra görüntü konumuna küçük objektif getirilir ve x100 objektif kullanılmışsa ucundaki yağın fazlası yumuşak kağıtla temizlenir. Deneyimlerimize göre en sık yapılan bir diğer hata immersiyon objektifinin yağlı bırakılmasıdır. Bu durumda zamanla objektifi  temizlenmesi güç, kalın yapışkan bir tabaka kaplar.
9. Unutulmaması gereken en önemli bir nokta da tozun mikroskobun düşmanı olduğudur. Kullanılmadığı zaman mikroskobun üzeri mutlaka bir örtüyle kapatılmalıdır.

Mikroskobun ve Merceklerinin Temizlenmesi

Prof Dr Yücel Tangün’ün Olympus marka mikroskobu (1984)

Mikroskobun işi bittikten sonra immersiyon objektifi yumuşak kağıtla silinir. Kalan yağ  bu kağıda az miktarda emdirilmiş temizleme solüsyonu ( 7 kısım eter ve 3 kısım alkol) ile hafifçe ovalanır. Aşırı ve gereksiz temizleme solüsyonu kullanılması merceklerde aşınma ve çizilmelere neden olabilir. İmmersiyon yağı bulaşmış diğer küçük büyültmeli objektifler de aynı şekilde temizlenmelidir. Yağ kuruduğunda temizlenmesi zordur. Sedir yağı gibi bazı yağlar çabuk kurur ve bunların temizlenmesi için aşırı miktarda kullanılan temizlik solüsyonu ve özellikle ksilol merceklerin yüzeyindeki çok ince filtre tabakasının zarar görmesine neden olabilir.

Okülerleri temizlerken merceklere elle dokunulmamalıdır. Mercekler silinmeden önce üzerlerindeki tozlar mutlaka yumuşak bir fırçayla uzaklaştırılmalıdır. Daha sonra yumuşak bir kağıda emdirilmiş temizleme solüsyonu ile mercekler silinir. Kaba kağıtlarla tozlu merceklerin silinmesi  çiziklerin oluşmasına yol açabilir.

Mikrobiyolog Aykut Köroğlu