İmmünohematoloji: Eritrosit Antikorları

Tanım ve Tarihçe

İmmünohematoloji, başta eritrositler olmak üzere, kan hücreleri ile bağlantılı bağışıklık olaylarını, özellikle antijen-antikor reaksiyonlarını inceler. İmmünohematolojinin temelini 1900-1901 yıllarında, ilk kan grubunu (ABO sistemi)* tanımlayan Dr. Karl Landsteiner atmıştır. Bu bölümde öncelikle eritrosit antikorlarını ilgilendiren ana bilgiler özetlenecektir.

Karl Landsteiner (1868-1943). Avusturyalı hekim. Viyana Tıp Fakültesinden mezun oldu. Seroloji ve immünolojiye yönelmeden önce tıbbın değişik alanlarında (kimya, patoloji, bakteriyoloji) uzun süre çalıştı. 1900 yılında, kendisininkilerle ile birlikte beş meslektaşının serum ve yıkanmış eritrositlerini ayırarak bunları tüm olası bileşimlerde (kombinasyonlarda)  birbirleriyle karşılaştırdı ve bazı bileşimlerde aglütinasyon olduğunu, bazılarında ise olmadığını gözlemledi. Bu şekilde A ve B grupları ve bu iki antijeni taşımayan C grubu (sonradan O oldu)** tanımlanmış oldu. 1902’de iki çalışma arkadaşı bu üç gruba AB grubunu eklediler. Landsteiner daha sonraki yıllarda M, N ve P gruplarını bulmuş, soğuk antikorlar üzerinde çalışmış ve 1904’de Avusturyalı hekim Julius Donath (1870-1950) ile birlikte paroksismal soğuk hemoglobinürisi’ nden sorumlu bifazik antikoru tanımlamıştır (Donath-Landsteiner antikoru). Landsteiner 1929’da ABD uyruğuna geçmiş ve 1930’da Nobel fizyoloji ve tıp ödülünü kazanmıştır.

* O grubuna “O” mu yoksa “sıfır” mı demeliyiz? O grubundaki “O” Almanca “ohne (–sız)” sözcüğünün (ing “without”, fr “sans) ilk harfidir. “Antijensiz” anlamına gelir. A ve B antijenlerinin yokluğunu gösterir. Bu bakımdan, bizde yerleşmiş olan “sıfır grubu” deyimi aslında yanlıştır. Doğru olan “O” denmesidir.

** Tuvalete “yüznumara” diyoruz. Fransızca “sans” (okunuşu san), anlamı: (–sız). Fransızca “cent” (okunuşu san), anlamı: 100 (yüz). Fransada tuvalet kapılarına numara konmazken, biz (fr sans numéro=numarasız) yerine (yüznumara) demişiz! Eskiden kapılara “00(sıfır sıfır)” yazıldığını anımsıyorum.

Eritrosit Antikorları

Eritrositlerin yüzeyinde yer alan antijenlere yönelik antikorlar doğal ya da immün, komplet ya da inkomplet ve sıcak* ya da soğuk olabilirler. Ayrıca eritrosit antikorları alloantikor (eş an. izoantikor) ya da otoantikor olmak üzere iki gruba ayrılır.

* Değerli genç meslektaşım Prof Dr. A G T Sucak  ing “warm” için “sıcak” yerine “ılık” diyor ki, haklıdır (2011).

Doğal ve İmmün Antikorlar

Kişinin kendi eritrositlerinde bulunmayan kan grubu antijenlerine yönelik, görünür bir immünizasyon sonucu oluşmamış antikorlara “doğal” ya da “doğal olarak oluşmuş antikorlar” adı verilir. ABO sistemindeki anti-A ve anti-B gibi izohemaglütininler bu tür antikorlara örnektir.

Doğal antikorların nasıl oluştuğu kesinlikle bilinmez. İnsanda doğum sırasında bu antikorlar yoktur. Eritrositlerin polisakkarid antijenleri ile doğadaki bazı bakteri ve virus antijenleri arasında çapraz reaksiyon olduğu düşünülür. Kişi böyle antijenlerle karşılaştığında, kendi eritrositlerinde bulunmayanlara karşı antikor yapar.

Doğal antikorlar hemen daima eritrositlerin karbonhidrat yapısındaki antijenlerine yöneliktir (ABH, MN, P, Lewis, I ve i gibi). Genellikle IgM sınıfındandırlar. Bu nedenle de plasentadan geçemezler. Gene genellikle komplet antikorlardır ve antijenle reaksiyona 37^o C nin altında (optimum 4^o C) girerler (“soğuk antikorlar”) (aşağıya bkz).

İmmün antikorlar, kişinin kendi eritrositlerinde bulunmayan eritrosit antijenleri ile duyarlaşması sonucu oluşurlar. Bu immünizasyondan anne ile fetus arasındaki kan grubu uyuşmazlıkları (örn Rh uyuşmazlığı) ya da yanlış gruptan kan transfüzyonları (örn Rh negatif bir kişiye Rh pozitif kan verilmesi gibi) sorumludur.

İmmün antikorlar eritrositlerin protein yapısındaki antijenlerine yöneliktir (Rh, Kell, Kidd, Duffy gibi). Bu antijenlere “immünojenik antijenler” de denir. Bazı durumlarda ABO sistemi ile ilgili immün (doğal olmayan) anti-A ve anti-B antikorları da gelişebilir (örn anne ile fetus arasındaki ABO uyuşmazlığı).

İmmün antikorlar genellikle inkomplet, en uygun 37^o C’de reaksiyona giren (“sıcak”) ve IgG sınıfından antikorlardır (aşağıya bkz). Plasentadan geçebilirler (Tablo 1).

Tablo 1. Doğal ve immun eritrosit antikorlarının özellikleri

Komplet ve İnkomplet Antikorlar

Eritrosit antikorları in vitro olarak aglütinasyon yöntemleri ile ortaya konur. İzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri kümeleştirebilen antikorlara “komplet”, kümeleştiremeyenlere “inkomplet” adı verilir.

Ig moleküllerinin en az iki (örn monomer yapısındaki IgG’de olduğu gibi) ya da daha fazla sayıda (örn pentamer yapısındaki IgM’de beş) antijenle bağlanma yerleri vardır. Normalde süspansiyon durumundaki eritrositlerin yüzeyinde negatif bir elektrostatik yük bulutu bulunur. İki eritrositi birbirinden uzaklaştıran bu negatif yüke “zeta potansiyel” denir. Zeta potansiyeli etkileyen başlıca faktörler, eritrosit membranı yüzeyinin özellikleri ve eritrositlerin içinde bulundukları ortamdır. Bir Ig molekülünün iki eritrosit arasında köprü kurabilmesi için geri itici elektrostatik gücü yenmesi gerekir. İzotonik tuzlu su ortamında; büyük, pentamer şeklinde bir molekül olan IgM zeta potansiyelin üstesinden gelerek eritrositleri kolaylıkla birleştirir. Buna karşılık çok daha küçük bir molekül olan IgG, aynı ortamda eritrositleri aglütine edemez (Şekil 1).

Şekil 1. Eritrosit aglütinasyonu. İzotonik tuzlu suda, IgM sınıfından komplet antikorlar zeta potansiyeli yenerler (üstte solda). IgG sınıfından inkomplet antikorlar izotonik tuzlu suda aglütinasyon yapamazlar (üstte sağda). İnkomplet antikorların aglütinasyon yapabilmeleri için eritrositlerin kolloidal bir ortama konmaları ya da proteolitik enzimlerle inkübasyonu gerekir (altta).

Doğal antikorlar ve soğuk aglütininler IgM sınıfından komplet antikorlardır. Çoğu immün antikorlar ve otoimmün hemolitik anemilerde görülen “sıcak” otoantikorlar ise IgG sınıfından “inkomplet” antikorlardır.

İnkomplet antikorlarla aglütinasyon sağlayabilmek için zeta potansiyeli değiştirecek yöntemlere başvurmak gerekir. Örn eritrositlerin, membran yüzeyini bozan proteolitik enzimlerle (papain, bromelin) işlenmesi ya da eritrositlerin kolloidal bir ortamda (% 20-30’luk sığır albumini) süspansiyonu gibi. Eritrositlerin yüzeyini kaplayan inkomplet antikorların saptanmasında sıklıkla kullanılan bir diğer yöntem direkt Coombs (antiglobülin) testi’ dir.

Robert Royston Amos (Robin) Coombs (1921-2006). Edinburgh Üniversitesinde Veterinerlik Fakültesini bitirdi (1943). Ardından emekli oluncaya dek çalışacağı Cambridge Üniversitesi Patoloji Bölümüne girdi. 1945 yılında savaşın sürdüğü sıralarda Dr Arthur Mourant ve Dr Robe Race ile birlikte –bu iki isim de transfüzyon tıbbı için çok önemlidir- yeni keşfedilen “inkomplet” rhesus antikorları üzerinde çalışıyor ve bu antikorlarla eritrositleri nasıl aglütine ettirebileceklerini araştırıyorlardı. Bir gün trenle Cambridge’e dönerken esin perisinin yardımı ile kafasında birdenbire bir şimşek çaktı. “Eritrositlerin üzerinde globulin antikorları var. İnsan serum globülinine karşı hazırlanacak bir antikorla bu eritrositlerin aglütine olması gerekir.” (Obituary. Lancet 2006; 367, 1234).

Şekil 2 Direkt Coombs testi. İzotonik tuzlu suda, inkomplet IgG antikorları eritrositleri aglütine edemez. Ortama anti-IgG antikorlarının (Coombs serumu) konması ile zeta potansiyel aşılarak aglütinasyon sağlanır.

Direkt Coombs (Antiglobülin) Testi

IgG tipinde inkomplet antikorlarla kaplı eritrositleri düşünelim. Bu antikorlar zeta potansiyeli yenemediğinden eritrositler bir araya gelemez. Eğer ortama, hayvanlardan hazırlanmış (örn tavşan) insan IgG’sine karşı antikorlar (anti-IgG) içeren bir bağışık serum eklersek, bu anti-IgG’ler eritrositlerin yüzeyindeki IgG’lerle köprüler kurarak birleşmeyi sağlarlar. İşte böyle bir bağışık seruma “Coombs (antiglobülin) serumu” adı verilir (Şekil 2).

Coombs serumu hayvanlara (örn tavşan) insan Ig’leri şırınga edilerek hazırlanır. İnsan serumunun tüm globülin fraksiyonu şırınga edilebileceği gibi – bu durumda polivalan bir Coombs serumu elde edilir – belirli bir Ig fraksiyonu (örn IgG fraksiyonu) ya da bir kompleman komponenti (örn. C3) şırınga edilebilir. Bu sonuncu koşullarda elde edilen Coombs serumları monospesifiktir. Örn soğuk aglütinin hastalığı’ nda direkt Coombs testi anti-C3 serumları ile pozitif sonuç verir.

Direkt Coombs testi eritrositlere in vivo yapışmış IgG sınıfından allo- ve otoantikorların saptanmasında kullanılır. “Sıcak” antikorlu otoimmün hemolitik anemilerde direkt Coombs pozitif bulunur. Rh uyuşmazlığına bağlı yeni doğanın hemolitik hastalığında ise, kordon kanı eritrositleri ile yapılan test pozitiftir.

İncelenecek eritrositler yıkanarak plazmalarından uzaklaştırılır. Ardından Coombs serumu ile inkübe edilirler. Aglütinasyon oluşursa sonuç pozitiftir. Eskiden tüpde yapılırdı. Şimdi jel teknolojisi kullanılıyor.

İndirekt Coombs Testi

Bu testle hasta serumunda eritrositlere yapışmamış inkomplet antikorlar aranır. Fetus-anne Rh uyuşmazlıklarında gebe kadınların prenatal izleminde; eritrosit transfüzyonlarından önce, alıcıların serumunda “atipik” antikorların aranmasında indirekt testten yararlanılır. Bazı “sıcak” antikorlu otoimmün hemolitik anemi olgularında, direkt Coombs ile birlikte indirekt test de pozitif bulunabilir. Bu bulgu prognozun ciddiliğine işaret eder.

İncelenecek hasta serumu önce O Rh (+) eritrositlerle ya da “atipik” antikorların aranmasında, antijenleri bilinen eritrositlerle inkübe edilir. İnkübasyon, serumda inkomplet antikorlar varsa, bunların eritrositlere yapışmasını sağlar. Daha sonra, eritrositler yıkanır ve direkt testte olduğu gibi, Coombs serumu ile karşılaştırılır.

“Sıcak (ılık)” ve “Soğuk” Antikorlar

Eritrosit-antikor etkileşiminin geliştiği ortamın ısısına göre, eritrosit antikorları “sıcak” ya da “sıcakta reaksiyona girenler” ve “soğuk” ya da “soğukta reaksiyona girenler” olmak üzere ikiye ayrılırlar. Sıcak antikorlar maksimum reaksiyonu normal vücut ısısında (37^oC dolayları) gösterirler. Buna karşılık, soğuk antikorların eritrositlerle birleşmesi, genellikle 30^oC’nin altında ve maksimum 4^oC’de olur. Isı yükseldiğinde, soğuk antikorlar eritrositlerden tekrar ayrılır.

Bir soğuk antikorun “ısı genişliği (termal amplitüd)” dendiğinde, o antikorun eritrositlerle reaksiyona girebildiği en yüksek ısı derecesi (örn 30-31^oC) anlaşılır. Antikorun termal amplitüdü özellikle soğuk aglutinin hastalığı’ nda klinik belirtilerin ağırlığı ve çeşitliliği açısından önem taşır.

Alloantikorlar ve Otoantikorlar

Eritrosit antijenlerine karşı duyarlaşma (immünizasyon) sonucu oluşan immün antikorlar, “alloantikor” ve “otoantikor” olmak üzere ikiye ayrılırlar.

Bir türde (örn insan), aynı genetik lokus tarafından denetlenen farklı (alelik) antijenlere “alloantijen” denir. Bu antijenlere karşı gelişen antikorlar alloantikorlar’dır. Alloantikor “izoantikor” ile eş anlamdadır. Feto-maternel kan grubu uyuşmazlıklarında ve uyuşur (kompatibl) olmayan kan transfüzyonlarından sonra alloimmünizasyon söz konusudur.

Otoantikorlar, bireyin kendi ( ing self), öz antijenlerine karşı gelişmiş antikorlardır. Aynı türdeki hemen hemen tüm bireylerin eritrosit antijenleri ile reaksiyon verirler. “Sıcak” ya da “soğuk” tipte olabilen eritrosit otoantikorları otoimmün hemolitik anemilere yol açar. Çok nadiren ilaç allerjileri sonucu, eritrosit otoantikorları gelişebilir.

Eritrosit otoantikorları antijenik özgüllüğe (ing. specificity) sahiptir. Sıcak otoantikorlar (IgG) genellikle Rh sistemi antijenlerine yöneliktir (örn anti-e). Soğuk antikorlu otoimmun hemolitik anemilerdeki soğuk aglutininler (IgM) genellikle anti-I ya da anti-i özgüllüğü taşırlar. Paroksismal soğuk hemoglobinürisi’ ndeki Donath-Landsteiner antikoru (IgG) anti-P özgüllüğündedir.

Eritrosit-Antikor Etkileşiminin Sonuçları

Eritrositlere yönelik antikorlar aşağıdaki değişik mekanizmalarla eritrositlerin yıkımına (immün hemoliz) yol açarlar.

1. Opsonik yapışma (aderans) ve fagositoz. Monositler, dalak ve karaciğerde bulunan makrofajlar Fc reseptörleri ile IgG sınıfı antikorlarla kaplanmış eritrositleri yakalar ve fagosite edebilirler (opsonik aderans). Bu durumda hemoliz ekstravasküler’ dir. Makrofajlarda komplemanın C3b komponentine karşı C3b reseptörleri de bulunduğundan, C3b ile kaplanmış eritrositler bu yolla da yapışabilir (immün aderans) ve fagositoza uğrayabilirler.

Yapışma her zaman fagositoz ile sonlanmayabilir. Bazen yapışma geçici bir süre içindir. Bu sırada makrofaj eritrosit membranından bir parça koparır ve ardından serbest kalan hücre sferosit şeklini alarak bütünlüğünü korur. Sıcak antikorlu otoimmün hemolitik anemilerde sferositoz sık rastlanan bir bulgudur. Sferositoza yol açan antikorlar IgG sınıfındandır (özellikle IgG1 ve IgG3). Sferositlerin osmotik ve mekanik frajiliteleri arttığından, özellikle dalak sinüzoidlerinden geçerken yaşam süreleri kısalır.

2. Kompleman çağlayanının tümüyle aktivasyonu. Bazı eritrosit antikorları komplemanı C9’a kadar aktive ederek eritrosit membranında delikler açarlar. ABO sisteminin doğal antikorları (IgM) ve soğuk aglütininler (IgM) buna örnektir. Hemoliz intravasküler’ dir. IgM sınıfı antikorlar dışında, IgG1 ve IgG3 sınıfı antikorlar da komplemanı bağlayabilirler.

3. Soğuk aglütinasyon. Termal amplitüdü yüksek soğuk antikorlar 30-32^oC’ye dek eritrositleri aglütine edebilirler. Vücudün soğuğa açık, burun, kulaklar, parmaklar gibi uç bölgelerinin yüzeyel kapillerlerinde aglütinasyonu sağlayacak bu ısı mevcuttur. Böylece antikor hem hastalığın vasküler semptomatolojisini yaratır (akrosiyanoz, hatta nekroz, livedo reticularis), hem de eritrosit yüzeyine kompleman komponentlerini bağlar. Dolaşan kan çevreden 37^oC’de olan merkeze döndüğünde, antikor ayrıldığı, dolayısıyla aglütinasyon çözüldüğü halde, kompleman hücre yüzeyinde kalır.

Antikor titresi çok yüksek ise, bir kısım hücre kompleman aktivasyonunun C9′ a kadar tamamlanmasıyla hemolize uğrayabilir (intravasküler hemoliz). Bu durumda hemoglobinüri ve kronik olgularda hemosiderinüri görülür. C3b ile kaplı hücrelerin C3b reseptörlü makrofajlar tarafından yakalanarak fagosite edilebileceklerini yukarda belirtmiştik. Bu tür makrofajların daha çok karaciğerde bulunduğunu ve hastaların bu nedenle splenektomiden yararlanmadıklarını eklemeliyiz.

Ancak hücrelerin çoğunluğunda, C3b’nin inaktivasyonu sonucu hücre yüzeyinde sadece C3d kalır ki, C3d’li hücreler, makrofajların C3d reseptörleri olmadığından ortadan kaldırılamaz. Dolaşmaya devam eden C3d kaplı eritrositlerde, antikorla karşılaştıklarında yeni bir kompleman aktivasyonu da başlayamaz. Bu nedenledir ki, ancak genç eritrositler hemolize uğrayabilir. İşte bu yüzden soğuk aglutinin hastalığı’ nda aşırı bir retikülositoz görülmez. Öte yandan, dolaşan hücrelerin yüzeyinde kalan C3d, komplemana karşı hazırlanmış immün serumlarla direkt Coombs testini pozitifleştirecektir (bkz. Soğuk aglütinin hastalığı).

Donath-Landsteiner antikoru: Paroksismal soğuk hemoglobinürisi’ ndeki hemolizden sorumlu olan bu poliklonal antikorlar, IgG sınıfından olmaları nedeniyle, soğukta eritrositleri aglütine edemezler. Ne var ki, soğukta eritrositlere komplemanın ilk komponentlerini yapıştırırlar. Kompleman aktivasyonunun tamamlanması ile oluşan intravasküler hemoliz ise 37^oC’de gerçekleşir. Bu nedenle Donath-Landsteiner antikoruna “bifazik antikor” da denir.

Kaynak: Y. Tangün. İmmünohematoloji s 213-235. İmmünoloji. Düzenleyen E. T. Çetin. İstanbul Tıp Fakültesi Vakfı – Bayda Yayını, 1981.